GSK-3β inhibition elicits a neuroprotection by restoring lysosomal dysfunction in neurons via facilitation of TFEB nuclear translocation after ischemic stroke

Zhang Y, Wu Z, Huang Z, Liu Y, Chen X, Zhao X, He H, Deng Y. Brain Res. 2022 Mar 1;1778:147768. doi: 10.1016/j.brainres.2021.147768. Epub 2021 Dec 27. PMID: 34968440.

Abstract Lysosomal dysfunction is an essential pathogenesis of autophagic neuronal injury after ischemic stroke. As a result of cerebral ischemia, transcription factor EB (TFEB) is greatly phosphorylated by prominently activated glycogen synthase kinase-3β (GSK-3β). This increased TFEB phosphorylation decreases its nuclear translocation and subsequently leads to reduced lysosomal biosynthesis, which ultimately results in lysosomal dysfunction. The present study is to investigate whether the lysosomal dysfunction in neurons can be restored to alleviate post-stroke damage by GSK-3β inhibition. The GSK-3β activity was inhibited by pre-treatment with CHIR-99021 (CHIR) for 3 days before middle cerebral artery occlusion (MCAO) surgery in rats. Besides, the lysosomal capacity was altered by pre-administration with Bafilomycin A1 (Baf-A1) and EN6, respectively. Twenty-four hours after MCAO/reperfusion, the penumbral tissues were obtained to detect the GSK-3β, cytoplasmic and nuclear TFEB, and proteins in autophagic/lysosomal pathway by western blot and immunofluorescence, respectively. Meanwhile, the infarct volume, neurological deficits and neuron survival were assessed to evaluate the neurological outcomes elicited by GSK-3β inhibition. The results demonstrated that the neurological injury could be significantly mitigated by GSK-3β inhibition in MCAO + CHIR group, compared with that in MCAO group. Moreover, CHIR-facilitated TFEB nuclear translocation in neurons was coupled with reinforced lysosomal activities and attenuated autophagic substrates. However, GSK-3β inhibition-induced neuroprotection was greatly counteracted by Baf-A1-weakened lysosomal capacity. Conversely, EN6-reinforced lysosomal activities further ameliorated the autophagic/lysosomal signaling, and synergistically alleviated the neurological damage upon GSK-3β inhibition after MCAO/reperfusion. Our data suggests that GSK-3β inhibition-augmented neuroprotection against ischemic stroke is elicited by restoring the lysosomal dysfunction in neurons.

뇌졸중 후 자가포식성 신경 손상의 주요 병리 기전 중 하나는 리소좀 기능장애임. 뇌허혈로 인해 글리코겐 합성효소 인산화효소-3β(GSK-3β)가 현저히 활성화되면서 전사인자 EB(TFEB)가 크게 인산화됨. 이러한 TFEB의 인산화 증가는 핵 내 이동을 감소시켜 리소좀 생합성을 저해하고, 결국 리소좀 기능장애를 유발함. 본 연구는 GSK-3β 억제를 통해 뉴런에서의 리소좀 기능장애를 회복하고, 이를 통해 뇌졸중 후 손상을 완화할 수 있는지를 규명하고자 함.

이를 위해 중간뇌동맥 폐색(MCAO) 수술 3일 전부터 랫드에 CHIR-99021(CHIR)을 투여하여 GSK-3β 활성을 억제하였으며, 동시에 Bafilomycin A1(Baf-A1)과 EN6를 각각 사전 투여하여 리소좀 기능을 조절함. MCAO/재관류 24시간 후에는 펜브라 부위의 조직을 채취하여 Western blot과 면역형광법을 통해 GSK-3β, 세포질 및 핵 내 TFEB, 그리고 자가포식/리소좀 경로 단백질을 분석함. 또한, GSK-3β 억제가 유도하는 신경학적 결과를 평가하기 위해 뇌경색 부피, 신경학적 손상 정도, 뉴런 생존율 등을 측정함.

그 결과, GSK-3β 억제(MCAO + CHIR 처리)가 이루어진 군은 단순 MCAO 군에 비해 신경학적 손상이 유의하게 완화됨. 더 나아가, CHIR 처리로 인한 뉴런 내 TFEB의 핵 내 이동 증가는 리소좀 기능이 강화되고 자가포식 기질이 감소하는 현상과 연관됨. 반면, Baf-A1을 통한 리소좀 기능 억제는 GSK-3β 억제에 의한 신경보호 효과를 상당 부분 상쇄시킴. 반대로 EN6를 통해 리소좀 활성을 강화하였을 때에는 자가포식/리소좀 신호가 추가로 개선되고, GSK-3β 억제로 인한 신경 손상이 더욱 효과적으로 완화됨.

종합적으로, 본 연구 결과는 허혈성 뇌졸중에서 GSK-3β 억제에 의한 신경보호 효과가 뉴런 내 리소좀 기능장애를 회복함으로써 발휘된다는 사실을 시사함.

[연구 배경 및 목적]

뇌졸중(허혈성 뇌졸중) 후 뉴런에서 오토파지 기전이 과도하게 활성화되지만, 리소좀 기능이 약화되어 오토파지 기질이 뉴런 내에 축적되는 자가포식 흐름(autophagy flux) 장애가 발생함. 실제로 급성 허혈성 뇌졸중에서 뉴런 내에 자가포식 기질(불필요한 단백질과 손상된 소기관 등)이 비정상적으로 축적되고 리소좀 기능이 크게 약화되어 있음이 관찰되었으며, 리소좀 기능을 강화하면 뇌졸중 후 자가포식/리소좀 기능장애가 개선되고 신경학적 손상이 완화되는 반면, 리소좀 기능을 억제하면 뇌 손상이 악화됨이 보고되었음. 이는 허혈성 뇌졸중 후 자가포식/리소좀 경로의 장애가 주로 리소좀 기능 부전에 기인함을 시사하며, 리소좀 생합성을 촉진하여 자가포식 흐름을 개선하는 것이 뇌졸중 손상을 줄이는 한 전략이 될 수 있음.

한편 TFEB(Transcription Factor EB)는 리소좀 생합성을 조절하는 핵심 전사인자로서, 핵으로 이동한 TFEB는 CLEAR 유전자 프로그램을 활성화하여 다양한 리소좀 관련 유전자의 발현을 증가시킴. TFEB의 핵 내 이동 여부는 인산화 상태에 의해 결정되는데, TFEB가 인산화되면 세포질에서 14-3-3 단백질에 결합되어 불활성화되고, 탈인산화되면 핵으로 빠르게 이동하여 리소좀 생성 유전자들의 전사를 촉진함. 일반적으로 mTORC1이 TFEB의 주요 인산화효소로 알려져 있으나, mTORC1 경로를 조절하면 염증, 세포자살 등 다른 경로에도 영향을 줄 수 있고 최근 연구에서는 리소좀 생합성이 mTORC1 이외의 PKC 같은 다른 키나아제들에 의해 조절될 수 있음이 제기되었음.

GSK-3β(Glycogen synthase kinase-3β)는 TFEB 인산화를 조절하는 또 다른 키나아제로, 뇌허혈 시 과활성화되어 TFEB의 Ser134와 Ser138 부위를 인산화하여 TFEB의 핵 내 이동을 억제하는 역할을 함. 뇌졸중 모델에서 GSK-3β의 활성이 증가하면 뉴런 사멸이 늘어나고 신경학적 손상이 악화된다는 보고들이 있으며, 반대로 GSK-3β 활성을 억제하면 뉴런 손실이 크게 줄고, 뇌경색 부피와 신경학적 결손이 유의하게 감소하는 등 신경보호 효과가 나타난다는 선행 연구 결과들이 축적되고 있음. 이에 본 연구진은 허혈성 뇌졸중 후 GSK-3β가 과활성화되어 TFEB를 과인산화함으로써 TFEB의 핵 이동과 리소좀 생성을 저해하고, 그 결과 뉴런의 리소좀 기능 장애와 자가포식 흐름 정체를 초래한다는 가설을 세움. 따라서 GSK-3β 활성을 억제하면 TFEB의 인산화를 줄여 핵 내 이동을 촉진하고, 뉴런의 리소좀 기능을 회복시켜 뇌졸중 손상을 완화할 수 있는지를 규명하고자 본 연구를 수행함.

[실험 방법]

• 동물 및 세포 허혈 모델: 성체 흰쥐에 중대뇌동맥 폐색(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO) 수술을 시행하여 허혈성 뇌손상 동물모델을 구축함. 또한 신경세포 수준에서의 허혈 손상 모델도 사용하여 뉴런에서의 분자 기전을 분석함 (예: 저산소/저포도당 조건 부여 등 세포 환경에서 허혈성 스트레스 모사함).

• GSK-3β 억제 처리: GSK-3β 선택적 억제제인 CHIR-99021을 뇌졸중 유발 3일 전부터 반복 투여하여 GSK-3β 활성을 사전에 억제함. CHIR-99021은 실험 기간 동안 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection) 방식으로 투여하였으며, 허혈 발생 직후에도 추가로 투여하여 GSK-3β 활성 억제 효과를 유지함.

• TFEB 및 리소좀 관련 분자 분석: 허혈 손상 24시간 후 뇌 손상 주변부(페눔브라) 조직과 세포에서 TFEB의 세포질 대비 핵 내 이동 정도를 측정하고, TFEB의 인산화 상태 변화를 분석함. 아울러 리소좀의 생성 및 기능 지표인 LAMP1/2 (리소좀 막 단백질), 카텝신 B/D 등의 리소좀 단백질과 관련 유전자 발현 수준을 검사함. 이러한 단백질들은 웨스턴 블롯 및 면역형광법을 통해 정량 분석되었음.

• 오토파지(자가포식) 흐름 평가: 오토파지 활성 및 흐름 변화를 확인하기 위해 LC3-II(자가포식체 막 단백질)와 p62/SQSTM1(자가포식 기질 단백질)의 축적 정도를 측정함. 허혈 손상 후 LC3-II 단편의 축적과 p62의 불용성 응집 형태를 관찰하여 오토파지 분해 단계의 기능 저하 여부를 평가하고, GSK-3β 억제가 이러한 지표에 미치는 영향을 분석함.

• 리소좀 기능 조작 실험: GSK-3β 억제 효과가 리소좀 기능을 통해 매개되는지 확인하기 위해, 리소좀 억제제 Bafilomycin A1 (Baf-A1)과 리소좀 활성화제 EN6를 각각 CHIR-99021 처리군에 병용 투여함. Baf-A1은 리소좀-자가포식체 융합을 저해하는 약제로 리소좀 활성을 떨어뜨리고, EN6는 TFEB를 활성화시켜 리소좀 생성을 증가시키는 약제임. 두 약제를 CHIR-99021과 함께 뇌실내 주입하여 리소좀 기능을 인위적으로 조절한 뒤, 그에 따른 변화가 관찰함.

• 뇌 손상 및 신경학적 지표 평가: 뇌졸중 유발 24시간 후 동물의 신경학적 기능결손 점수(mNSS) 평가, 뇌 조직 TTC 염색을 통한 뇌경색 면적 측정, 그리고 뉴런 생존율 평가를 수행함. 뉴런 생존율은 뇌 조직의 Nissl 염색 및 NeuN 양성 세포 수 측정, Fluoro-Jade C 염색 등을 통해 확인하였음. 이를 통해 GSK-3β 억제에 따른 뇌 손상 크기와 뉴런 보호 효과를 종합적으로 평가함.

[주요 결과]

• GSK-3β 억제로 TFEB 탈인산화 및 핵 내 이동 증가: GSK-3β 억제제 CHIR-99021을 처리한 군에서는 과활성화된 GSK-3β가 억제되어 TFEB에 대한 과도한 인산화가 감소하고, 그 결과 TFEB의 핵 내 이동이 증가하였음. 즉, 허혈 단독 시 활성화된 GSK-3β가 TFEB를 인산화하여 세포질에 가두어두지만, GSK-3β 억제 시 TFEB가 탈인산화되어 14-3-3 단백질로부터 해리된 뒤 핵으로 이동함으로써 활성화됨.

• 리소좀 단백질 발현 증가 및 오토파지 흐름 회복: GSK-3β 억제 처리 결과 리소좀 막 단백질인 LAMP-2와 가수분해효소 카텝신 B/D의 발현이 허혈 단독 대비 유의하게 증가하였으며, 세포 내에 쌓여 있던 p62/SQSTM1 및 유비퀴틴화 단백질 등의 자가포식 기질이 감소함을 확인함. 이는 GSK-3β 억제가 손상된 자가포식 흐름을 복원하여, 쌓여 있던 불용성 단백질들이 분해되고 리소좀 기능이 강화되었음을 시사함. 또한 오토파지 초기 단계 지표인 Beclin-1 및 LC3-II 단백질량도 증가하여 오토파지 활성의 강화와 더불어 전체적인 자가포식-리소좀 경로 기능 회복이 이루어졌음을 보여줌.

• 뇌경색 부위 감소 및 신경학적 기능 개선: CHIR-99021 처리군에서 뇌 손상 규모가 현저히 줄어들고 신경학적 기능이 향상됨을 확인함. 구체적으로 GSK-3β 억제군은 허혈 대조군에 비해 뇌경색 부피가 유의하게 감소하고, 행동 실험에서 평가한 신경학적 결손 점수가 개선되었으며, 뉴런 생존률이 증가함을 보였음. 이러한 결과는 GSK-3β 억제를 통해 허혈로 인한 신경손상이 완화되고 뉴런 보호 효과가 나타났음을 의미함.

• 리소좀 억제제 병용 시 GSK-3β 억제 효과 상실: Baf-A1을 CHIR-99021과 함께 투여하여 리소좀 기능을 억제한 경우, GSK-3β 억제에 의해 유도된 리소좀 기능 강화 효과가 크게 소멸되었음. 그 결과 CHIR-99021 단독 투여 시 감소했던 p62 및 유비퀴틴화 단백질이 다시 축적되고, LAMP-2와 카텝신 등의 리소좀 단백질 증가가 억제되었으며, 최종적으로 뉴런 보호 효과와 뇌경색 감소 효과도 소실됨을 확인함. 즉, 리소좀 기능이 억제된 상황에서는 GSK-3β 억제의 자가포식/리소좀 경로 개선 효과가 무효화되어 신경보호 효과가 나타나지 않음.

• 리소좀 활성화제 병용 시 신경보호 효과 상승: TFEB 활성화제인 EN6를 CHIR-99021과 함께 처리하면, 리소좀 활성이 더욱 증가하여 오토파지/리소좀 신호가 한층 강화되고 자가포식 기질의 제거가 촉진됨과 동시에 신경보호 효과가 추가적으로 높아지는 시너지 효과를 보였음. EN6 병용군에서는 CHIR-99021 단독보다 뇌경색 크기가 더 감소하고 신경학적 회복 점수가 더 향상되었으며, 뉴런 손실이 더욱 줄어드는 등 전반적인 뇌 손상 지표가 유의하게 개선되었음. 이는 리소좀 기능을 증강시켜주면 GSK-3β 억제의 효과가 극대화되어 허혈성 뇌손상으로부터의 신경보호 효과가 상승함을 보여주는 결과임.

[결론 및 의의]

본 연구를 통해 GSK-3β 활성을 억제하면 TFEB의 핵 내 이동을 촉진함으로써 뇌졸중 후 뉴런의 리소좀 기능장애를 복원하고 자가포식 흐름을 정상화시켜 신경세포를 보호할 수 있음을 확인하였음. 요약하면, 허혈성 뇌손상 시 과활성화된 GSK-3β가 TFEB를 인산화하여 리소좀 생성을 저해하지만, GSK-3β 억제를 통해 TFEB를 활성화하면 리소좀 기능 회복과 손상 감소로 뇌졸중에 의한 신경학적 손상을 효과적으로 경감시킬 수 있음. 이러한 결과는 뇌졸중 치료 전략으로서 GSK-3β 및 TFEB-매개 리소좀 경로의 중요성을 부각시키며, 향후 새로운 치료 표적으로 활용될 수 있는 가능성을 제시함.